PAI-2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402054-ACT

SERPINB2 codifica l’inibitore dell’attivatore del plasminogeno-2 (PAI-2), un inibitore delle proteasi seriniche che modula la proteolisi pericellulare inibendo l’attivatore del plasminogeno di tipo urochinasi (uPA/PLAU), influenzando così la generazione di plasmina e il rimodellamento della matrice extracellulare. PAI-2 è indotto da segnali infiammatori ed è spesso studiato in monociti/macrofagi, cellule epiteliali e microambienti tumorali, dove interseca la fibrinolisi, la risposta alla ferita e reti di segnalazione guidate da citochine. Attraverso la regolazione di processi legati a uPA/uPAR, SERPINB2 influisce su migrazione e adesione cellulare, nonché su cascate di segnalazione dipendenti da proteasi rilevanti per il rimodellamento tissutale e l’attivazione immunitaria. Un’espressione alterata di SERPINB2/PAI-2 è stata associata a patologie infiammatorie e a fenotipi correlati al cancro, sostenendone l’impiego come nodo meccanicistico in studi sulla proteostasi e sul rimodellamento accoppiato all’infiammazione.

PAI-2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di SERPINB2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

PAI-2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus SERPINB2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione SERPINB2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di PAI-2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus SERPINB2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da PAI-2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via PAI-2 nelle cellule tumorali con espressione di SERPINB2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.