Plasmide CRISPR d'Activation (h) PAF-R: sc-402569-ACT

PTAFR code le récepteur du facteur d’activation plaquettaire (PAF‑R), un GPCR de classe A qui se lie au facteur d’activation plaquettaire et se couple principalement aux voies de signalisation Gαq/11 et Gαi pour réguler l’activation de la phospholipase C, les flux intracellulaires de Ca²⁺ et les programmes transcriptionnels en aval dépendants de MAPK et de NF‑κB. L’activité de PAF‑R intègre la détection des médiateurs lipidiques inflammatoires avec la chimiotaxie des leucocytes, l’activation endothéliale et la modulation des réseaux de cytokines et d’eicosanoïdes, influençant les réponses immunitaires innées et la perméabilité vasculaire. Une dérégulation de la signalisation PTAFR/PAF‑R a été associée à des processus inflammatoires et allergiques, à l’activation immunitaire liée aux infections et à la biologie du microenvironnement tumoral via des effets sur le comportement des cellules myéloïdes et la fonction de barrière. En tant que récepteur membranaire à signalisation rapide induite par le ligand, il constitue un point d’entrée exploitable pour disséquer l’inflammation médiée par les GPCR et les interactions croisées avec la signalisation lipidique.

PAF-R Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de PTAFR sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

PAF-R Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus PTAFR dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription PTAFR, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de PAF-R. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus PTAFR natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de PAF-R au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie PAF-R dans les cellules tumorales présentant une expression de PTAFR silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.