PAF acetylhydrolase 2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-410924-ACT

PAFAH2 codifica per la PAF acetilidrolasi 2, una fosfolipasi A2 citosolica che idrolizza il fattore attivante le piastrine (PAF) e i fosfolipidi ossidati, modulando così la segnalazione dei lipidi bioattivi e l’omeostasi dei lipidi di membrana. Limitando la segnalazione guidata dal PAF e rimuovendo i fosfolipidi perossidati, PAFAH2 contribuisce alla regolazione delle risposte infiammatorie, dello stress ossidativo e delle vie a valle legate alla sopravvivenza cellulare e al rimodellamento lipidico. Un controllo alterato del PAF e dei mediatori lipidici ossidati è stato associato a una segnalazione immunitaria disregolata e a fenotipi di stress metabolico, rendendo PAFAH2 rilevante per studi meccanicistici della disfunzione cellulare associata all’infiammazione.

PAF acetylhydrolase 2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di PAFAH2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

PAF acetylhydrolase 2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus PAFAH2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione PAFAH2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di PAF acetylhydrolase 2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus PAFAH2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da PAF acetylhydrolase 2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via PAF acetylhydrolase 2 nelle cellule tumorali con espressione di PAFAH2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.