p70 S6 kinase β Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400409-ACT

L’RPS6KB2 umano codifica la p70 S6 chinasi β, una chinasi serina/treonina della famiglia AGC che agisce a valle della segnalazione PI3K–AKT–mTOR, collegando segnali nutritivi e fattori di crescita alla sintesi proteica e alla crescita cellulare. Fosforilando substrati coinvolti nell’avvio della traduzione e nella biogenesi ribosomiale, la p70 S6 chinasi β contribuisce a regolare la dimensione cellulare, la proliferazione e l’adattamento metabolico al variare delle condizioni ambientali. La deregolazione della segnalazione mTOR/S6K è spesso studiata nel contesto delle alterazioni del metabolismo anabolico e delle risposte allo stress nel cancro e in altre patologie proliferative, dove un controllo traslazionale aberrante e segnali di feedback possono rimodellare l’output della via. L’attività di RPS6KB2 è rilevante anche per studi sulla segnalazione insulinica, la bioenergetica cellulare e il cross-talk con i processi associati a MAPK e all’autofagia.

p70 S6 kinase β Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di RPS6KB2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

p70 S6 kinase β Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus RPS6KB2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione RPS6KB2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di p70 S6 kinase β. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus RPS6KB2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da p70 S6 kinase β nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via p70 S6 kinase β nelle cellule tumorali con espressione di RPS6KB2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.