p55 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-409649-ACT

Il gene umano **MPP1** codifica la proteina di membrana palmitoilata **p55**, un fattore di impalcatura della famiglia **MAGUK** che contribuisce a organizzare complessi proteici associati alla membrana e ad accoppiarli al citoscheletro corticale di **actina–spettrina**. p55 partecipa alla stabilità delle giunzioni e all’architettura dei domini di membrana attraverso interazioni con proteine contenenti il dominio **FERM** e con altri adattatori citoscheletrici, influenzando forma cellulare, polarità e traffico intracellulare. Negli eritrociti, **MPP1** contribuisce all’integrità meccanica della membrana e all’organizzazione di microdomini specializzati, processi rilevanti per la deformabilità dei globuli rossi e per fenotipi legati alla stabilità di membrana. Alterazioni dell’impalcatura dipendente da p55 sono state studiate in contesti in cui l’ancoraggio al citoscheletro e la regolazione dei contatti cellula–cellula risultano perturbati, offrendo un quadro di riferimento per analizzare l’organizzazione della membrana in condizioni fisiologiche e associate a malattia.

p55 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di MPP1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

p55 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus MPP1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione MPP1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di p55. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus MPP1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da p55 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via p55 nelle cellule tumorali con espressione di MPP1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.