p53 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-416469-ACT

TP53 codifica il soppressore tumorale umano p53, un fattore di trascrizione specifico per sequenza che integra il riconoscimento del danno al DNA, lo stress oncogenico e i checkpoint del ciclo cellulare per mantenere la stabilità genomica. p53 regola programmi che controllano l’arresto in G1/S e G2/M, l’apoptosi, la senescenza e la riparazione del DNA tramite vie canoniche che coinvolgono la segnalazione ATM/ATR e bersagli trascrizionali quali CDKN1A (p21), BAX e MDM2. L’alterazione della funzione di TP53 è frequente nel cancro ed è associata a risposte allo stress modificate, instabilità cromosomica e un ampio rimaneggiamento trascrizionale. In quanto nodo centrale della biologia dello stress cellulare, p53 è ampiamente studiato nei meccanismi di trasformazione, nella resistenza allo stress genotossico e nel crosstalk tra vie di segnalazione PI3K–AKT e MAPK.

p53 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di TP53 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

p53 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus TP53 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione TP53, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di p53. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus TP53 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da p53 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via p53 nelle cellule tumorali con espressione di TP53 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.