p40-phox Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401461-ACT

NCF4 codifica p40-phox, una componente regolatoria del complesso NADPH ossidasi (NOX2) dei fagociti che modula l’assemblaggio e l’attività dell’ossidasi su endomembrane e fagosomi. Attraverso interazioni con p67-phox (NCF2), p47-phox (NCF1) e il citocromo di membrana b558, p40-phox contribuisce a controllare la generazione di specie reattive dell’ossigeno dipendente dallo stimolo, a supporto dell’uccisione microbica e della segnalazione redox. Questa via si integra con processi dell’immunità innata, inclusi fagocitosi, segnalazione dell’inflammasoma e risposte citochiniche, in cui un’alterata regolazione dell’ossidasi può perturbare la difesa dell’ospite e l’omeostasi infiammatoria. Un’attività NOX2 deregolata e la segnalazione dipendente da p40-phox sono state associate a fenotipi di immunodeficienza e infiammazione, offrendo un punto di accesso meccanicistico per studiare la regolazione del burst ossidativo nelle cellule mieloidi.

p40-phox Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di NCF4 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

p40-phox Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus NCF4 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione NCF4, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di p40-phox. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus NCF4 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da p40-phox nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via p40-phox nelle cellule tumorali con espressione di NCF4 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.