P2Y9 Particelle di Attivazione Lentivirale (m): sc-429620-LAC

Lpar4 codifica il recettore 4 dell’acido lisofosfatidico (spesso indicato come P2Y9), un GPCR che rileva l’acido lisofosfatidico extracellulare e trasduce i segnali attraverso proteine G eterotrimeriche per regolare i livelli di cAMP, il calcio intracellulare e l’attività della via MAPK/ERK. Nelle cellule murine, LPAR4/P2Y9 influenza il rimodellamento del citoscheletro, l’adesione cellulare e il comportamento migratorio, integrandosi in reti più ampie di segnalazione mediate da lipidi che modellano lo sviluppo dei tessuti e la comunicazione immuno–stromale. Una segnalazione LPA–LPAR deregolata è stata associata a rimodellamento infiammatorio, disfunzioni metaboliche e segnali del microambiente associati ai tumori, rendendo Lpar4 un nodo utile per studi meccanicistici sui fenotipi cellulari guidati dai GPCR. Questo bersaglio viene frequentemente analizzato per collegare la segnalazione lipidica a programmi trascrizionali che controllano proliferazione, funzione di barriera e differenziamento.

Le particelle di attivazione lentivirale P2Y9 (m) rispondono a questa esigenza incapsulando il sistema completo di attivazione trascrizionale del mediatore di attivazione sinergica (SAM) in particelle lentivirali ad alto titolo pronte per la trasduzione, consentendo un'efficiente sovraregolazione di Lpar4 in una gamma più ampia di tipi di cellule umane.

Le particelle di attivazione lentivirale P2Y9 (m) veicolano tutti i componenti funzionali del sistema del mediatore di attivazione sinergica (SAM) tramite trasduzione lentivirale. Il sistema comprende tre preparati di particelle co-trasdotti nelle cellule bersaglio: uno che codifica per dCas9 cataliticamente inattivo (mutazioni D10A e N863A) fuso al dominio di transattivazione VP64 con un gene di resistenza alla blasticidina; una che codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1 con un gene di resistenza all'igromicina; e una che codifica un sgRNA di 20 nt specifico per il bersaglio fuso a due aptameri di RNA MS2 con un gene di resistenza alla puromicina. A seguito della trasduzione lentivirale e dell'integrazione genomica dei cassetti di espressione, i componenti del SAM vengono espressi in modo stabile e si assemblano nel locus bersaglio all'interno della regione promotrice prossimale a monte del sito di inizio della trascrizione Lpar4, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo cooperativo per reclutare il machinery trascrizionale endogeno e guidare una sovraregolazione sostenuta dell'espressione endogena di P2Y9. L'uso di dCas9 inattivo nei confronti delle nucleasi evita l'introduzione di rotture del DNA a doppio filamento e preserva il locus genomico nativo Lpar4 e l'architettura regolatoria.

Il formato lentivirale offre diversi vantaggi pratici: l'integrazione genomica stabile supporta l'attivazione ereditaria attraverso le divisioni cellulari; le preparazioni di particelle ad alto titolo eliminano la necessità di una produzione virale interna; e la compatibilità con tipi di cellule primarie, non in divisione e resistenti alla trasfezione amplia l'accessibilità sperimentale. Il successo della trasduzione può essere confermato e potenziato attraverso una selezione antibiotica tripla utilizzando puromicina, igromicina e blasticidina.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.