p19 INK4D/CDKN2D Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401761-ACT

CDKN2D codifica p19^INK4D, un membro della famiglia INK4 di inibitori delle chinasi ciclina‑dipendenti che frena selettivamente l’attività di CDK4 e CDK6, imponendo il checkpoint G1/S. Limitando la fosforilazione delle proteine RB e modulando i programmi trascrizionali guidati da E2F, p19^INK4D contribuisce al controllo della proliferazione, della differenziazione e della senescenza cellulare. CDKN2D è integrato nelle reti del ciclo cellulare e della risposta allo stress, con rilevanza funzionale in contesti di segnalazione oncogenica in cui l’integrità dell’asse CDK4/6–RB influenza il controllo della crescita. Alterazioni nella regolazione di CDKN2D sono state studiate nella biologia del cancro e in altri stati iperproliferativi per comprendere l’elusione dei checkpoint, l’impegno di linea e la stabilità del genoma.

p19 INK4D/CDKN2D Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CDKN2D senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

p19 INK4D/CDKN2D Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CDKN2D nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CDKN2D, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di p19 INK4D/CDKN2D. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CDKN2D nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da p19 INK4D/CDKN2D nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via p19 INK4D/CDKN2D nelle cellule tumorali con espressione di CDKN2D silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.