P15RS Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403743-ACT

RPRD1A codifica la proteina umana P15RS, un fattore che interagisce con il CTD, si associa alla RNA polimerasi II e contribuisce ad accoppiare la trascrizione con il processamento dell’RNA co-trascrizionale. Attraverso la modulazione della dinamica di fosforilazione del CTD della polimerasi e delle interazioni con regolatori trascrizionali, P15RS influenza programmi di espressione genica legati al controllo del ciclo cellulare, alla segnalazione del danno al DNA e a processi associati alla cromatina. La disregolazione del controllo trascrizionale e del processamento dell’RNA è una caratteristica ricorrente dei fenotipi proliferativi e di risposta allo stress, rendendo RPRD1A un bersaglio utile per studi meccanicistici in biologia del cancro e in disturbi correlati dell’espressione genica. I ricercatori sfruttano comunemente la perturbazione di RPRD1A per mappare reti trascrizionali, interrogare vie dipendenti dalla RNA polimerasi II e profilare cambiamenti trascrittomici e proteomici a valle.

P15RS Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di RPRD1A senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

P15RS Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus RPRD1A nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione RPRD1A, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di P15RS. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus RPRD1A nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da P15RS nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via P15RS nelle cellule tumorali con espressione di RPRD1A silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.