p14ARF/p16 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400018-ACT

CDKN2A codifica due distinte proteine oncosoppressori, p14ARF e p16INK4a, che coordinano il controllo dei checkpoint in risposta allo stress oncogenico. p16INK4a inibisce CDK4/6 per mantenere RB in uno stato ipo‑fosforilato e limitare la progressione G1–S, mentre p14ARF stabilizza la segnalazione di p53 antagonizzando MDM2, collegando lo stress nucleolare ai programmi di apoptosi e senescenza. Un’alterata espressione di CDKN2A o la sua inattivazione è frequentemente associata a un controllo deregolato del ciclo cellulare, a una senescenza compromessa e a instabilità genomica nella biologia dei tumori. Il locus è inoltre ampiamente utilizzato per modellare le vie che regolano l’invecchiamento cellulare, la proliferazione e l’arresto della crescita indotto da stress.

p14ARF/p16 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CDKN2A senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

p14ARF/p16 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CDKN2A nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CDKN2A, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di p14ARF/p16. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CDKN2A nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da p14ARF/p16 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via p14ARF/p16 nelle cellule tumorali con espressione di CDKN2A silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.