p115 Particelle di Attivazione Lentivirale (h): sc-403918-LAC

USO1 codifica p115, un fattore di tethering periferico di membrana a coiled-coil che coordina l’ancoraggio e la fusione delle vescicole nella fase iniziale della via secretoria. p115 fa da ponte tra i trasportatori derivati da COPII e le membrane del Golgi interagendo con le GTPasi Rab e con le golgine, sostenendo il traffico dal RE al Golgi, l’organizzazione del “Golgi ribbon” e il riassemblaggio mitotico del Golgi. Attraverso il suo ruolo nel traffico di membrana e nell’architettura degli organelli, p115 influenza la proteostasi, l’esposizione in superficie di recettori e integrine e gli output di segnalazione legati a proliferazione e migrazione. Il trasporto secretorio deregolato e le vie di stress del Golgi che coinvolgono p115 sono stati studiati in contesti quali neurodegenerazione, infezioni e alterazioni della glicosilazione e della secrezione associate al cancro.

Le particelle di attivazione lentivirale p115 (h) rispondono a questa esigenza incapsulando il sistema completo di attivazione trascrizionale del mediatore di attivazione sinergica (SAM) in particelle lentivirali ad alto titolo pronte per la trasduzione, consentendo un'efficiente sovraregolazione di USO1 in una gamma più ampia di tipi di cellule umane.

Le particelle di attivazione lentivirale p115 (h) veicolano tutti i componenti funzionali del sistema del mediatore di attivazione sinergica (SAM) tramite trasduzione lentivirale. Il sistema comprende tre preparati di particelle co-trasdotti nelle cellule bersaglio: uno che codifica per dCas9 cataliticamente inattivo (mutazioni D10A e N863A) fuso al dominio di transattivazione VP64 con un gene di resistenza alla blasticidina; una che codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1 con un gene di resistenza all'igromicina; e una che codifica un sgRNA di 20 nt specifico per il bersaglio fuso a due aptameri di RNA MS2 con un gene di resistenza alla puromicina. A seguito della trasduzione lentivirale e dell'integrazione genomica dei cassetti di espressione, i componenti del SAM vengono espressi in modo stabile e si assemblano nel locus bersaglio all'interno della regione promotrice prossimale a monte del sito di inizio della trascrizione USO1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo cooperativo per reclutare il machinery trascrizionale endogeno e guidare una sovraregolazione sostenuta dell'espressione endogena di p115. L'uso di dCas9 inattivo nei confronti delle nucleasi evita l'introduzione di rotture del DNA a doppio filamento e preserva il locus genomico nativo USO1 e l'architettura regolatoria.

Il formato lentivirale offre diversi vantaggi pratici: l'integrazione genomica stabile supporta l'attivazione ereditaria attraverso le divisioni cellulari; le preparazioni di particelle ad alto titolo eliminano la necessità di una produzione virale interna; e la compatibilità con tipi di cellule primarie, non in divisione e resistenti alla trasfezione amplia l'accessibilità sperimentale. Il successo della trasduzione può essere confermato e potenziato attraverso una selezione antibiotica tripla utilizzando puromicina, igromicina e blasticidina.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.