p115 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403918-ACT

USO1 codifica il fattore di tethering vescicolare p115, una proteina coiled-coil conservata che coordina il trasporto dal reticolo endoplasmatico (RE) al Golgi e il trasporto intra-Golgi collegando i rivestimenti delle vescicole con i componenti della matrice del Golgi e con il macchinario SNARE. p115 contribuisce al mantenimento della struttura del Golgi, al traffico direzionale di membrane e all’omeostasi della via secretoria, influenzando così la processazione delle proteine e la loro consegna alla superficie cellulare. Alterazioni del traffico legato a USO1 possono influire sulla proteostasi, sulle risposte allo stress e sugli output di segnalazione che dipendono dalla secrezione regolata e dal turnover dei recettori di membrana. Un trasporto vescicolare e un’organizzazione del Golgi deregolati sono spesso associati a trasformazione oncogena e a fenotipi neurodegenerativi, rendendo USO1 un nodo utile per studiare le conseguenze, a livello di via, delle disfunzioni secretorie.

p115 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di USO1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

p115 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus USO1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione USO1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di p115. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus USO1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da p115 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via p115 nelle cellule tumorali con espressione di USO1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.