P/Q-type Ca⁺⁺ CP α1A Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404267-ACT

CACNA1A codifica la subunità α1A che forma il poro dei canali del calcio voltaggio-dipendenti di tipo P/Q (CaV2.1), che mediano l’ingresso di Ca²⁺ attivato da alti voltaggi nelle cellule eccitabili. Nei neuroni, CaV2.1 è arricchito nelle zone attive presinaptiche, dove accoppia la depolarizzazione di membrana alla fusione delle vescicole sinaptiche dipendente dal Ca²⁺, modulando la probabilità di rilascio dei neurotrasmettitori, la plasticità a breve termine e l’eccitabilità della rete. L’attività del canale si integra con vie di segnalazione regolate dal Ca²⁺, inclusa la modulazione dipendente dalla calmodulina, la fosforilazione da parte di PKA/PKC e programmi trascrizionali a valle sensibili alla dinamica del Ca²⁺ intracellulare. La variazione genetica o la disregolazione di CACNA1A è associata a fenotipi neurologici che coinvolgono circuiti cerebellari e corticali, a supporto del suo impiego in studi di fisiologia sinaptica e dei meccanismi neuro-sviluppativi.

P/Q-type Ca++ CP α1A Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CACNA1A senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

P/Q-type Ca++ CP α1A Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CACNA1A nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CACNA1A, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di P/Q-type Ca++ CP α1A. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CACNA1A nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da P/Q-type Ca++ CP α1A nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via P/Q-type Ca++ CP α1A nelle cellule tumorali con espressione di CACNA1A silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.