Oxr1 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-431284-ACT

Il gene murino Oxr1 (oxidation resistance 1) codifica una proteina responsiva allo stress che sostiene la resilienza neuronale e cellulare al danno ossidativo modulando l’omeostasi redox e preservando l’integrità del genoma. Oxr1 è implicato nella funzione mitocondriale, nella detossificazione delle specie reattive dell’ossigeno e nelle vie di risposta al danno del DNA che influenzano la sopravvivenza cellulare sotto stress metabolico o ambientale. Alterazioni dell’espressione di Oxr1 sono state associate a fenotipi rilevanti per la neurodegenerazione e a una maggiore sensibilità alle lesioni ossidative, rendendolo utile per lo studio dei meccanismi di mantenimento neuronale e di adattamento allo stress. In quanto regolatore della tolleranza allo stress ossidativo, Oxr1 rappresenta un nodo facilmente interrogabile per analizzare il crosstalk tra disfunzione mitocondriale, segnalazione del danno al DNA e proteostasi.

Oxr1 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Oxr1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Oxr1 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Oxr1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Oxr1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Oxr1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Oxr1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Oxr1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Oxr1 nelle cellule tumorali con espressione di Oxr1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.