osteopontin/OPN/SPP1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400219-ACT

SPP1 codifica l’osteopontina (OPN), una fosfoglicoproteina secreta che agisce come citochina associata alla matrice extracellulare, influenzando adesione, migrazione e sopravvivenza cellulare tramite l’interazione con integrine e con il recettore CD44. OPN regola la segnalazione infiammatoria e il rimodellamento tissutale coordinando la chemiotassi dei leucociti, la polarizzazione dei macrofagi e l’attività degli osteoclasti, e integra segnali provenienti dalle adesioni focali e dalla dinamica del citoscheletro per modulare le interazioni cellula‑matrice. L’espressione di SPP1 risulta spesso alterata in contesti di infiammazione cronica, fibrosi, rimodellamento cardiovascolare e dialogo tra tumore e microambiente immunitario, dove può modulare invasione, angiogenesi e reclutamento delle cellule immunitarie. Queste proprietà rendono SPP1 un nodo utile per studiare la segnalazione extracellulare, la regolazione immunitaria e i fenotipi guidati dalla matrice in modelli cellulari umani.

osteopontin/OPN/SPP1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di SPP1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

osteopontin/OPN/SPP1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus SPP1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione SPP1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di osteopontin/OPN/SPP1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus SPP1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da osteopontin/OPN/SPP1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via osteopontin/OPN/SPP1 nelle cellule tumorali con espressione di SPP1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.