ORMDL2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403585-ACT

ORMDL2 (orosomucoid-like 2) è una proteina di membrana del reticolo endoplasmatico (RE) che partecipa all’omeostasi degli sfingolipidi modulando l’attività della serina palmitoiltransferasi e bilanciando la sintesi di ceramide e sfingomielina. Attraverso questa funzione, ORMDL2 influenza la composizione della membrana del RE, la gestione del calcio e la segnalazione dello stress del RE, collegando il metabolismo lipidico alla proteostasi e alle risposte infiammatorie. Alterazioni nella regolazione della famiglia ORMDL sono state associate a infiammazione delle vie aeree, tratti legati all’asma e fenotipi immunometabolici più ampi, rendendo ORMDL2 un bersaglio utile per studiare la segnalazione guidata dai lipidi nelle cellule umane. La sua posizione all’intersezione tra biosintesi degli sfingolipidi e vie di risposta allo stress supporta ricerche meccanicistiche su come il flusso lipidico nel RE modelli le funzioni dell’immunità innata e di barriera.

ORMDL2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ORMDL2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

ORMDL2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ORMDL2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ORMDL2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di ORMDL2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ORMDL2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da ORMDL2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via ORMDL2 nelle cellule tumorali con espressione di ORMDL2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.