Plásmido CRISPR de Activación (h) ORC2: sc-402746-ACT

El ORC2 humano codifica una subunidad central del complejo de reconocimiento del origen (ORC), que se une a los orígenes de replicación y coordina el ensamblaje del complejo de prerreplicación para garantizar que la síntesis de ADN ocurra una sola vez por ciclo celular. ORC2 funciona en la interfaz entre la regulación de la cromatina y el licenciamiento de la replicación, integrándose con CDC6, CDT1 y la carga de la helicasa MCM durante G1, y favoreciendo la entrada en fase S y la estabilidad del genoma. La alteración de la actividad de ORC2 puede comprometer la temporización de la replicación y la progresión de las horquillas, aumentando el estrés replicativo y las respuestas a daño en el ADN que con frecuencia se activan en trastornos proliferativos. Como determinante central de la competencia de los orígenes de replicación, ORC2 se estudia ampliamente en el control del ciclo celular, el metabolismo del ADN asociado a la cromatina y los mecanismos que protegen la integridad genómica.

ORC2 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de ORC2 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

ORC2 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus ORC2 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional ORC2, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de ORC2. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo ORC2 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de ORC2 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía ORC2 en células tumorales con expresión de ORC2 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.