Orai2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403535-ACT

L’ORAI2 umano codifica Orai2, una subunità essenziale del canale del calcio attivato dal rilascio di calcio (CRAC), che media l’ingresso di calcio dipendente dai depositi (store‑operated calcium entry) in seguito alla deplezione di Ca2+ nel reticolo endoplasmatico (RE). Controllando l’afflusso di Ca2+ nel citosol, Orai2 modula programmi di segnalazione a valle, inclusi la trascrizione calcineurina–NFAT, l’attività delle MAPK e altre vie Ca2+-dipendenti che plasmano l’attivazione immunitaria, la secrezione e, più in generale, l’accoppiamento tra stimolo e risposta. Alterazioni dell’espressione di ORAI2 o dell’equilibrio dei canali CRAC possono spostare le soglie della segnalazione del calcio, contribuendo a una segnalazione infiammatoria disregolata, a una proliferazione cellulare aberrante e a risposte allo stress dipendenti dal contesto. Di conseguenza, ORAI2 è spesso studiato in modelli di funzione delle cellule immunitarie, di segnalazione epiteliale e di meccanismi che collegano l’omeostasi del Ca2+ a fenotipi rilevanti per la malattia.

Orai2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ORAI2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Orai2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ORAI2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ORAI2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Orai2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ORAI2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Orai2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Orai2 nelle cellule tumorali con espressione di ORAI2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.