Olfr303 Plasmídeo de ativação de CRISPR (m): sc-434741-ACT

Olfr303 codifica um receptor olfatório de camundongo pertencente à superfamília de GPCRs classe A do tipo rodopsina, normalmente expresso em neurônios sensoriais olfatórios, onde contribui para a detecção de odorantes e a transdução de sinais. Após a ligação do ligante, os receptores olfatórios acoplam-se a vias mediadas por proteína G que promovem a produção de AMPc, a atividade de canais regulados por nucleotídeos cíclicos, a despolarização da membrana e programas transcricionais a jusante envolvidos na atividade neuronal e na adaptação sensorial. Além da olfação, foi relatada expressão ectópica de receptores olfatórios em diversos tecidos, o que motiva estudos sobre a regulação, via GPCR, da sinalização celular, da diferenciação e da detecção do microambiente. A sinalização desregulada de GPCRs é amplamente relevante para a neurobiologia e a biologia do câncer, tornando o Olfr303 um modelo útil para investigar estados de sinalização impulsionados por receptores em sistemas murinos.

Olfr303 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de Olfr303 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Olfr303 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus Olfr303 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição Olfr303, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Olfr303. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus Olfr303 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Olfr303 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Olfr303 em células tumorais com expressão de Olfr303 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.