OAT1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404284-ACT

Il gene umano SLC22A6 codifica il trasportatore di anioni organici 1 (OAT1), un trasportatore basolaterale del tubulo prossimale renale che media l’assorbimento di metaboliti endogeni e di anioni organici xenobiotici dal sangue verso le cellule epiteliali. OAT1 funziona all’interno di reti di trasportatori della famiglia SLC che accoppiano lo scambio di anioni organici alla gestione cellulare di urato, tossine uremiche e coniugati farmacologici, influenzando la secrezione renale e la clearance sistemica. Modulando l’esposizione intracellulare a metaboliti e farmaci, l’attività di SLC22A6 si intreccia con vie associate alle risposte di stress tubulare e alla tossicologia dipendente dal trasporto. Un’espressione o una funzione alterata di OAT1 è stata associata, in modelli sperimentali, a variazioni nella disposizione dei farmaci e nella suscettibilità a risposte avverse a livello renale, a supporto della sua rilevanza per la nefrologia e la ricerca farmacocinetica.

OAT1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di SLC22A6 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

OAT1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus SLC22A6 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione SLC22A6, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di OAT1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus SLC22A6 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da OAT1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via OAT1 nelle cellule tumorali con espressione di SLC22A6 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.