Nup133 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402822-ACT

NUP133 codifica Nup133, un componente centrale del complesso Y (sottocomplesso Nup107–160) che funge da impalcatura per l’assemblaggio del complesso del poro nucleare e supporta il trasporto nucleo‑citoplasmatico. Organizzando l’architettura del poro, Nup133 influenza l’esportazione dell’mRNA, l’importazione delle proteine e il rimodellamento dell’involucro nucleare accoppiato al ciclo cellulare, contribuendo così a modellare i programmi trascrizionali e la stabilità del genoma. Alterazioni della composizione dei pori nucleari e della dinamica del trasporto sono collegate a difetti nella proliferazione e differenziazione cellulare e nelle risposte allo stress, e la disregolazione delle vie dei nucleoporini è stata associata, in sistemi sperimentali, a disturbi dello sviluppo e a fenotipi correlati al cancro. In quanto nucleoporina strutturale, Nup133 è utilizzata anche per studiare l’integrità dell’involucro nucleare, l’organizzazione della cromatina vicino alla periferia nucleare e le vie di segnalazione dipendenti da un import/export nucleare regolato.

Nup133 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di NUP133 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Nup133 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus NUP133 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione NUP133, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Nup133. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus NUP133 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Nup133 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Nup133 nelle cellule tumorali con espressione di NUP133 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.