NRAMP 2 Particelle di Attivazione Lentivirale (h): sc-418176-LAC

SLC11A2 codifica NRAMP2 (DMT1), un trasportatore di ioni metallici bivalenti accoppiato ai protoni che media l’assorbimento cellulare e l’esportazione endosomiale del ferro ferroso e di altri metalli di transizione. NRAMP2 è fondamentale per l’assorbimento intestinale del ferro e per il rilascio del ferro dal ciclo della transferrina negli endosomi, collegandolo a endocitosi, acidificazione vescicolare e vie dell’omeostasi dei metalli che influenzano il metabolismo mitocondriale e le risposte allo stress ossidativo. La disregolazione di SLC11A2 è associata ad anemia microcitica ereditaria con sovraccarico di ferro e contribuisce a fenotipi di gestione del ferro rilevanti per neurodegenerazione, infiammazione e stress metabolico. In quanto trasportatore di membrana con regolazione dipendente dal contesto, NRAMP2 è spesso studiato in modelli di sensing dei nutrienti, biologia redox e interazioni ospite–patogeno, in cui la disponibilità di metalli modella la funzione cellulare.

Le particelle di attivazione lentivirale NRAMP 2 (h) rispondono a questa esigenza incapsulando il sistema completo di attivazione trascrizionale del mediatore di attivazione sinergica (SAM) in particelle lentivirali ad alto titolo pronte per la trasduzione, consentendo un'efficiente sovraregolazione di SLC11A2 in una gamma più ampia di tipi di cellule umane.

Le particelle di attivazione lentivirale NRAMP 2 (h) veicolano tutti i componenti funzionali del sistema del mediatore di attivazione sinergica (SAM) tramite trasduzione lentivirale. Il sistema comprende tre preparati di particelle co-trasdotti nelle cellule bersaglio: uno che codifica per dCas9 cataliticamente inattivo (mutazioni D10A e N863A) fuso al dominio di transattivazione VP64 con un gene di resistenza alla blasticidina; una che codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1 con un gene di resistenza all'igromicina; e una che codifica un sgRNA di 20 nt specifico per il bersaglio fuso a due aptameri di RNA MS2 con un gene di resistenza alla puromicina. A seguito della trasduzione lentivirale e dell'integrazione genomica dei cassetti di espressione, i componenti del SAM vengono espressi in modo stabile e si assemblano nel locus bersaglio all'interno della regione promotrice prossimale a monte del sito di inizio della trascrizione SLC11A2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo cooperativo per reclutare il machinery trascrizionale endogeno e guidare una sovraregolazione sostenuta dell'espressione endogena di NRAMP 2. L'uso di dCas9 inattivo nei confronti delle nucleasi evita l'introduzione di rotture del DNA a doppio filamento e preserva il locus genomico nativo SLC11A2 e l'architettura regolatoria.

Il formato lentivirale offre diversi vantaggi pratici: l'integrazione genomica stabile supporta l'attivazione ereditaria attraverso le divisioni cellulari; le preparazioni di particelle ad alto titolo eliminano la necessità di una produzione virale interna; e la compatibilità con tipi di cellule primarie, non in divisione e resistenti alla trasfezione amplia l'accessibilità sperimentale. Il successo della trasduzione può essere confermato e potenziato attraverso una selezione antibiotica tripla utilizzando puromicina, igromicina e blasticidina.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.