NPAS2 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-405236-ACT

Humanes NPAS2 (neuronal PAS domain protein 2) ist ein Transkriptionsfaktor der bHLH-PAS-Familie (basic helix–loop–helix PAS) und fungiert als zentrale Komponente der molekularen zirkadianen Uhr. NPAS2 bildet mit ARNTL/BMAL1 Heterodimere, bindet an E-Box-Elemente und treibt rhythmische Transkriptionsprogramme an, die den Schlaf-Wach-Rhythmus, den Stoffwechsel, die Hormonsignalgebung und die neuronale Erregbarkeit steuern. Über die transkriptionelle Kontrolle von uhrkontrollierten Genen integriert NPAS2 Umwelt- und zelluläre Signale mit Signalwegen wie zirkadianer Entrainment (Synchronisation) und Energiehomöostase. Eine Fehlregulation NPAS2-assoziierter transkriptioneller Netzwerke wurde mit verändertem zirkadianem Verhalten in Verbindung gebracht und in Kontexten wie neuropsychiatrischen Phänotypen, metabolischen Merkmalen und krebsassoziierten Störungen der Uhr untersucht.

NPAS2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen NPAS2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

NPAS2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des NPAS2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der NPAS2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen NPAS2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native NPAS2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von NPAS2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des NPAS2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem NPAS2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.