Notch 4 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400766-ACT

Il gene umano **NOTCH4** codifica **Notch 4**, un recettore transmembrana a singolo passaggio che media la segnalazione juxtacrina per regolare le decisioni sul destino cellulare, l’impegno di linea e l’omeostasi tissutale. In seguito al legame con il ligando, la processamento proteolitico rilascia il dominio intracellulare di Notch, che trasloca nel nucleo e coopera con **CSL/RBPJ** e coattivatori per controllare programmi trascrizionali che governano proliferazione e differenziamento. L’attività di **NOTCH4** è strettamente integrata con processi di sviluppo e vascolari e può intersecarsi con vie quali **WNT**, **TGF-β** e la segnalazione infiammatoria per modulare i fenotipi delle cellule endoteliali e immunitarie. Una segnalazione di Notch 4 deregolata è stata collegata ad alterate risposte angiogeniche e a stati del microambiente associati al tumore, rendendola rilevante per studi meccanicistici di oncogenesi e biologia vascolare.

Notch 4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di NOTCH4 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Notch 4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus NOTCH4 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione NOTCH4, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Notch 4. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus NOTCH4 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Notch 4 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Notch 4 nelle cellule tumorali con espressione di NOTCH4 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.