NOR-1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401813-ACT

NR4A3 codifica NOR-1, un recettore nucleare orfano che funge da fattore di trascrizione immediato-precoce, integrando segnali mitogeni e di stress in programmi genici dipendenti dal contesto. NOR-1 influenza la differenziazione cellulare, la proliferazione, l’apoptosi e l’adattamento metabolico modulando reti trascrizionali a valle di vie quali MAPK/ERK e cAMP/PKA, con crosstalk con la segnalazione infiammatoria. Nelle cellule immunitarie e vascolari, NR4A3 contribuisce alla regolazione dell’espressione genica responsiva alle citochine e al cambio di fenotipo, supportando studi su infiammazione, angiogenesi e rimodellamento tissutale. Un’attività alterata di NR4A3 e un riassetto (rewiring) trascrizionale sono stati associati a processi oncogenici ed ematologici, rendendolo un nodo utile per indagare circuiti di regolazione genica rilevanti per la malattia.

NOR-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di NR4A3 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

NOR-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus NR4A3 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione NR4A3, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di NOR-1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus NR4A3 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da NOR-1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via NOR-1 nelle cellule tumorali con espressione di NR4A3 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.