nm23-H1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401221-ACT

NME1 codifica nm23-H1, una chinasi dei nucleosidi difosfato che mantiene l’equilibrio cellulare tra NTP e NDP e contribuisce a processi di segnalazione legati a proliferazione, motilità e risposte allo stress. nm23-H1 è stata implicata nella regolazione della dinamica del citoscheletro, del traffico di membrana e di programmi trascrizionali che modellano la migrazione e la differenziazione cellulare. Un’espressione alterata di NME1 è frequentemente studiata nel contesto della biologia tumorale, dove è stata associata all’invasività e al comportamento metastatico in modo dipendente dal tipo cellulare e dal contesto. In quanto gene umano ampiamente espresso, NME1 rappresenta un nodo utile per interrogare l’accoppiamento tra metabolismo e segnalazione e la plasticità fenotipica in modelli cellulari ingegnerizzati.

nm23-H1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di NME1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

nm23-H1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus NME1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione NME1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di nm23-H1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus NME1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da nm23-H1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via nm23-H1 nelle cellule tumorali con espressione di NME1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.