NKCC1 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-422971-ACT

Slc12a2 nel topo codifica NKCC1 (SLC12A2), un cotrasportatore elettroneutro Na⁺-K⁺-2Cl⁻ che regola l’omeostasi del cloruro intracellulare, il controllo del volume cellulare e la secrezione di fluidi negli epiteli. Determinando i livelli citosolici di Cl⁻, NKCC1 influenza l’eccitabilità di membrana e la neurotrasmissione inibitoria attraverso interazioni con la segnalazione GABAergica e con reti più ampie di trasporto ionico. L’attività di NKCC1 contribuisce alle risposte allo stress osmotico e al movimento transepiteliale dei sali negli epiteli secretori, collegandola a processi fisiologici nel sistema nervoso, nel polmone e nel tratto gastrointestinale. Un trasporto di cloruro dipendente da NKCC1 deregolato è stato associato a modelli di ipereccitabilità neurologica e a fenotipi infiammatori delle vie aeree e dell’intestino, a supporto di studi meccanicistici sull’equilibrio ionico in contesti rilevanti per la malattia.

NKCC1 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Slc12a2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

NKCC1 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Slc12a2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Slc12a2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di NKCC1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Slc12a2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da NKCC1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via NKCC1 nelle cellule tumorali con espressione di Slc12a2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.