Nix Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401982-ACT

A BNIP3L (Nix) humana codifica uma proteína pró-apoptótica do tipo BH3-only, associada às mitocôndrias, que atua como recetor de mitofagia ao interagir com proteínas da família LC3/GABARAP através do seu motivo LIR. A Nix integra o controlo de qualidade mitocondrial com a morte celular programada e a adaptação ao stress, ligando a sinalização responsiva à hipóxia e a despolarização mitocondrial à eliminação seletiva de mitocôndrias danificadas. Contribui para a maturação eritroide através da remoção de mitocôndrias e pode influenciar a reprogramação metabólica, a homeostase de espécies reativas de oxigénio e a sinalização inflamatória. A expressão ou o turnover desregulados de BNIP3L/Nix têm sido associados a fenótipos alterados de mitofagia e apoptose descritos em modelos de biologia do cancro, neurodegeneração e stress cardiovascular, apoiando estudos mecanísticos de disfunção mitocondrial.

Nix O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de BNIP3L sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Nix O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus BNIP3L em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição BNIP3L, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Nix. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus BNIP3L nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Nix no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Nix em células tumorais com expressão de BNIP3L silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.