NIK Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-424749-ACT

Map3k14 codifica la chinasi induttrice di NF-κB (NIK), una chinasi serina/treonina che funge da regolatore centrale della via non canonica di NF-κB. NIK integra i segnali provenienti da specifici membri della superfamiglia dei recettori del TNF per promuovere l’attivazione di IKKα e il processamento di p100 (NF-κB2) in p52, plasmando così programmi trascrizionali che controllano lo sviluppo linfoide, la sopravvivenza delle cellule B e la segnalazione infiammatoria. Un controllo rigoroso della stabilità e dell’attività di NIK è essenziale per l’omeostasi immunitaria e, in modelli sperimentali, una segnalazione NIK–NF-κB2 disregolata è stata collegata a stati infiammatori anomali e a processi biologici associati a neoplasie linfoidi. Nei sistemi murini, Map3k14 è ampiamente utilizzato per analizzare il crosstalk tra la segnalazione non canonica di NF-κB, le reti citochiniche e le decisioni di destino cellulare nei compartimenti immunitari e stromali.

NIK Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Map3k14 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

NIK Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Map3k14 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Map3k14, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di NIK. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Map3k14 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da NIK nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via NIK nelle cellule tumorali con espressione di Map3k14 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.