NHE-2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404353-ACT

SLC9A2 codifica lo scambiatore Na+/H+ NHE-2, un antiporto della membrana plasmatica che regola il pH intracellulare, il volume cellulare e l’assorbimento di sodio accoppiando l’ingresso di Na+ all’efflusso di H+. L’attività di NHE-2 sostiene il trasporto epiteliale di ioni e fluidi e contribuisce al mantenimento della funzione di barriera della mucosa, collegandosi a vie che governano il movimento transepiteliale degli elettroliti e l’omeostasi acido–base. Attraverso un controllo pH-dipendente dell’attività enzimatica, della dinamica del citoscheletro e dell’integrità delle giunzioni, NHE-2 influenza la proliferazione e le risposte allo stress nelle cellule polarizzate. Un’alterata regolazione dello scambio Na+/H+ è stata associata ad anomalie del trasporto gastrointestinale e renale e a fenotipi correlati all’infiammazione, rendendo SLC9A2 un bersaglio rilevante per studi meccanicistici della fisiologia epiteliale e del rimodellamento del trasporto associato alla malattia.

NHE-2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di SLC9A2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

NHE-2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus SLC9A2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione SLC9A2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di NHE-2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus SLC9A2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da NHE-2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via NHE-2 nelle cellule tumorali con espressione di SLC9A2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.