NHE-1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400748-ACT

SLC9A1 codifica lo scambiatore umano Na+/H+ 1 (NHE-1), un antiporto della membrana plasmatica che espelle H+ intracellulari in cambio di Na+ extracellulari per mantenere il pH citosolico, regolare il volume cellulare e sostenere l’omeostasi ionica. L’attività di NHE-1 si integra con la segnalazione mediata dai fattori di crescita e con il rimodellamento del citoscheletro, influenzando proliferazione, migrazione e adattamento allo stress, e contribuisce al controllo pH-dipendente del metabolismo e dell’attività enzimatica. Una funzione disregolata di NHE-1 e dell’omeostasi del pH è stata collegata ad alterazioni dei programmi di sopravvivenza e motilità cellulare nella biologia dei tumori, nonché a meccanismi di danno correlati all’ischemia nella ricerca cardiovascolare e neurologica. Poiché NHE-1 accoppia il trasporto ionico a output di segnalazione, SLC9A1 è frequentemente studiato in vie che coinvolgono MAPK/ERK, le GTPasi Rho e le risposte cellulari a ipossia e stress ossidativo.

NHE-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di SLC9A1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

NHE-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus SLC9A1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione SLC9A1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di NHE-1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus SLC9A1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da NHE-1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via NHE-1 nelle cellule tumorali con espressione di SLC9A1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.