NFAT5 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401359-ACT

NFAT5 (fattore nucleare delle cellule T attivate 5), noto anche come proteina legante gli enhancer sensibile alla tonicità, è un fattore di trascrizione della famiglia Rel che coordina programmi genici osmo-adattativi nelle cellule umane. Regola l’espressione di trasportatori, chaperoni ed enzimi metabolici che mantengono l’equilibrio ionico e la proteostasi in condizioni di stress ipertonico, integrando segnali provenienti dalle vie p38/MAPK, JNK e da pathway calcio-dipendenti. L’attività di NFAT5 influenza sopravvivenza, proliferazione e differenziamento cellulare in contesti immunitari, della midollare renale ed epiteliali, e la sua deregolazione è stata associata alla segnalazione infiammatoria, alle risposte tissutali allo stress e all’adattamento delle cellule tumorali a microambienti sfavorevoli. In quanto mediatore centrale della trascrizione responsiva alla tonicità e allo stress, NFAT5 è ampiamente studiato per i suoi ruoli nella regolazione delle citochine, nella funzione di barriera e nei meccanismi di resilienza cellulare.

NFAT5 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di NFAT5 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

NFAT5 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus NFAT5 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione NFAT5, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di NFAT5. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus NFAT5 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da NFAT5 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via NFAT5 nelle cellule tumorali con espressione di NFAT5 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.