NF-YA Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401085-ACT

NFYA codifica la subunità NF‑YA del fattore di trascrizione eterotrimerico NF‑Y, che si lega ai motivi della CCAAT box e coordina l’architettura dei promotori con lo stato della cromatina per controllare la trascrizione basale e inducibile. NF‑YA contribuisce alla regolazione della progressione del ciclo cellulare, della replicazione e riparazione del DNA, dei programmi genici metabolici e delle vie di risposta allo stress attraverso interazioni cooperative con altri fattori di trascrizione e complessi coattivatori. Alterazioni dell’attività di NFYA o delle reti di geni bersaglio di NF‑Y sono state associate a proliferazione e differenziamento deregolati, con rilevanza per programmi trascrizionali oncogenici e per cambiamenti più ampi dell’espressione genica osservati in molteplici contesti patologici. Queste proprietà rendono NFYA un nodo utile per interrogare la regolazione guidata dai promotori, i circuiti trascrizionali e il rewiring delle vie di segnalazione in modelli cellulari umani.

NF-YA Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di NFYA senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

NF-YA Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus NFYA nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione NFYA, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di NF-YA. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus NFYA nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da NF-YA nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via NF-YA nelle cellule tumorali con espressione di NFYA silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.