Neutrophil Elastase Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400677-ACT

ELANE codifica l’elastasi neutrofila, una proteasi serinica immagazzinata nei granuli azurofili che viene rilasciata durante la degranulazione e la formazione delle trappole extracellulari dei neutrofili (NET) per rimodellare la matrice extracellulare e degradare proteine microbiche e dell’ospite. La sua attività contribuisce alla segnalazione dell’immunità innata modellando i gradienti di chemochine e modulando i mediatori infiammatori, con una regolazione rigorosa da parte di antiproteasi endogene per prevenire danni tissutali collaterali. Un’espressione o un’attività deregolata dell’elastasi neutrofila è implicata nel danno tissutale infiammatorio e in alterate interazioni ospite–patogeno, e varianti di ELANE sono state associate a fenotipi ereditari di neutropenia che influenzano la granulopoiesi. Di conseguenza, ELANE è spesso studiato in modelli di differenziamento mieloide, equilibrio proteasi–antiproteasi e patologie infiammatorie.

Neutrophil Elastase Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ELANE senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Neutrophil Elastase Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ELANE nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ELANE, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Neutrophil Elastase. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ELANE nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Neutrophil Elastase nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Neutrophil Elastase nelle cellule tumorali con espressione di ELANE silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.