nephrin Plasmídeo de ativação de CRISPR (m): sc-424905-ACT

O gene Nphs1 de camundongo codifica a nefrina, uma proteína transmembranar da superfamília das imunoglobulinas que forma o núcleo do diafragma de fenda dos podócitos e é essencial para a integridade da barreira de filtração glomerular. A nefrina participa de complexos multiproteicos com podocina e CD2AP e se conecta à remodelação do citoesqueleto de actina por meio de vias de sinalização que incluem PI3K/AKT e quinases da família Src, sustentando a sobrevivência e a arquitetura dos podócitos. Alterações na expressão ou na localização da nefrina desorganizam a estrutura do diafragma de fenda, levando a permeabilidade alterada e a fenótipos associados à proteinúria, amplamente estudados em modelos de doença renal. Como marcador enriquecido em podócitos, a regulação de Nphs1 é frequentemente investigada em estudos de desenvolvimento glomerular, respostas a lesão e manutenção da barreira de filtração.

nephrin O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de Nphs1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

nephrin O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus Nphs1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição Nphs1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de nephrin. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus Nphs1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de nephrin no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via nephrin em células tumorais com expressão de Nphs1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.