NEDD8 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-417924-ACT

NEDD8 codifica la proteina ubiquitina-simile NEDD8, un modificatore chiave nella via della neddilazione che si coniuga covalentemente alle proteine scaffold cullin per attivare le ligasi E3 ubiquitina cullin–RING (CRL). Attraverso la regolazione dell’ubiquitinazione dipendente dalle CRL, NEDD8 influenza la proteostasi, la progressione del ciclo cellulare, la replicazione e la riparazione del DNA e la segnalazione della risposta allo stress. L’attività delle CRL dipendente da NEDD8 modella il turnover di molti regolatori a breve emivita, collegando la neddilazione al controllo dei checkpoint e ai programmi trascrizionali. La neddilazione deregolata e la funzione alterata delle CRL sono spesso studiate nel contesto di fenotipi proliferativi e proteotossici, instabilità genomica e rimodellamento delle vie di segnalazione osservati in diversi modelli di malattia.

NEDD8 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di NEDD8 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

NEDD8 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus NEDD8 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione NEDD8, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di NEDD8. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus NEDD8 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da NEDD8 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via NEDD8 nelle cellule tumorali con espressione di NEDD8 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.