NEDD4-L Particelle di Attivazione Lentivirale (h): sc-403647-LAC

NEDD4L codifica NEDD4-L, una ligasi E3 dell’ubiquitina di tipo HECT che regola il turnover proteico catalizzando l’ubiquitinazione di substrati di membrana e citosolici. Modula il trasporto ionico e l’omeostasi epiteliale attraverso il controllo di canali e trasportatori come ENaC, e contribuisce alla dinamica della segnalazione regolando finemente recettori e componenti di via tramite traffico e degradazione dipendenti dall’ubiquitina. L’attività di NEDD4-L interseca vie tra cui TGF-β/SMAD, Wnt/β-catenina e la segnalazione PI3K–AKT, influenzando polarità cellulare, differenziamento e risposte allo stress. La deregolazione dell’espressione o della funzione di NEDD4L è stata associata ad alterazioni dell’equilibrio del sodio e a fenotipi cardiovascolari, ed è stata riportata in molteplici contesti rilevanti per la malattia, inclusi cancro e rimodellamento fibrotico, rendendola un nodo utile per studi meccanicistici della segnalazione dell’ubiquitina.

Le particelle di attivazione lentivirale NEDD4-L (h) rispondono a questa esigenza incapsulando il sistema completo di attivazione trascrizionale del mediatore di attivazione sinergica (SAM) in particelle lentivirali ad alto titolo pronte per la trasduzione, consentendo un'efficiente sovraregolazione di NEDD4L in una gamma più ampia di tipi di cellule umane.

Le particelle di attivazione lentivirale NEDD4-L (h) veicolano tutti i componenti funzionali del sistema del mediatore di attivazione sinergica (SAM) tramite trasduzione lentivirale. Il sistema comprende tre preparati di particelle co-trasdotti nelle cellule bersaglio: uno che codifica per dCas9 cataliticamente inattivo (mutazioni D10A e N863A) fuso al dominio di transattivazione VP64 con un gene di resistenza alla blasticidina; una che codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1 con un gene di resistenza all'igromicina; e una che codifica un sgRNA di 20 nt specifico per il bersaglio fuso a due aptameri di RNA MS2 con un gene di resistenza alla puromicina. A seguito della trasduzione lentivirale e dell'integrazione genomica dei cassetti di espressione, i componenti del SAM vengono espressi in modo stabile e si assemblano nel locus bersaglio all'interno della regione promotrice prossimale a monte del sito di inizio della trascrizione NEDD4L, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo cooperativo per reclutare il machinery trascrizionale endogeno e guidare una sovraregolazione sostenuta dell'espressione endogena di NEDD4-L. L'uso di dCas9 inattivo nei confronti delle nucleasi evita l'introduzione di rotture del DNA a doppio filamento e preserva il locus genomico nativo NEDD4L e l'architettura regolatoria.

Il formato lentivirale offre diversi vantaggi pratici: l'integrazione genomica stabile supporta l'attivazione ereditaria attraverso le divisioni cellulari; le preparazioni di particelle ad alto titolo eliminano la necessità di una produzione virale interna; e la compatibilità con tipi di cellule primarie, non in divisione e resistenti alla trasfezione amplia l'accessibilità sperimentale. Il successo della trasduzione può essere confermato e potenziato attraverso una selezione antibiotica tripla utilizzando puromicina, igromicina e blasticidina.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.