NDUFB5 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-410902-ACT

NDUFB5 umano codifica una piccola subunità accessoria del complesso I della catena respiratoria mitocondriale (NADH:ubichinone ossidoreduttasi) che supporta il corretto assemblaggio e il trasferimento di elettroni nell’ambito della fosforilazione ossidativa. Contribuendo al pompaggio di protoni e al mantenimento del potenziale di membrana mitocondriale, NDUFB5 influenza la produzione di ATP e l’omeostasi redox, processi strettamente collegati alla segnalazione mediata dalle ROS e all’adattamento metabolico. Un’alterazione della funzione del complesso I è ampiamente rilevante per la biologia delle malattie mitocondriali ed è stata osservata in contesti di disfunzione neuromuscolare, neurodegenerazione e metabolismo tumorale, in cui sono prominenti lo stress bioenergetico e il rimodellamento mitocondriale. Di conseguenza, NDUFB5 è un bersaglio utile per studiare l’integrità della catena respiratoria, la comunicazione mito-nucleare e le vie che collegano il metabolismo energetico alle decisioni sul destino cellulare.

NDUFB5 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di NDUFB5 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

NDUFB5 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus NDUFB5 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione NDUFB5, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di NDUFB5. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus NDUFB5 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da NDUFB5 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via NDUFB5 nelle cellule tumorali con espressione di NDUFB5 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.