NDNF Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-405602-ACT

Il fattore neurotrofico di derivazione neuronale (NDNF) è una glicoproteina secreta, associata alla matrice extracellulare, arricchita nel sistema nervoso, che sostiene la sopravvivenza neuronale, la crescita dei neuriti e la maturazione sinaptica. Nel cervello in sviluppo e in quello adulto, NDNF contribuisce ai circuiti degli interneuroni e alla plasticità dipendente dall’attività, collegandosi così ai processi che modellano la connettività corticale e l’equilibrio eccitatorio-inibitorio. Un’alterata espressione di NDNF è stata associata a fenotipi neuroevolutivi e neuropsichiatrici, ed è frequentemente studiata in modelli di differenziamento neuronale, risposta allo stress e disfunzioni dei circuiti a livello di rete. Queste caratteristiche rendono NDNF un nodo utile per esplorare i programmi trascrizionali che regolano il mantenimento dei neuroni e la stabilità delle reti neurali.

NDNF Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di NDNF senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

NDNF Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus NDNF nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione NDNF, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di NDNF. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus NDNF nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da NDNF nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via NDNF nelle cellule tumorali con espressione di NDNF silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.