Ndn Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-421839-ACT

Il gene murino Ndn codifica la necdina, una proteina della famiglia MAGE con ruoli di primo piano nella differenziazione neuronale, nella sopravvivenza e nel mantenimento degli stati post-mitotici. La necdina partecipa a reti di regolazione della trascrizione e del ciclo cellulare modulando le interazioni con fattori quali le proteine della famiglia E2F e vie associate a p53, collegandola così al controllo della proliferazione e alle risposte allo stress nelle linee cellulari neurali. È inoltre connessa allo sviluppo neuroendocrino e ai processi di segnalazione ipotalamica che influenzano il bilancio energetico e la fisiologia riproduttiva. La deregolazione dell’espressione di Ndn è associata a fenotipi neuroevolutivi legati all’imprinting ed è spesso studiata nel contesto della biologia della regione di Prader–Willi e delle disfunzioni neuronali correlate.

Ndn Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Ndn senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Ndn Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Ndn nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Ndn, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Ndn. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Ndn nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Ndn nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Ndn nelle cellule tumorali con espressione di Ndn silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.