NDH II Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402757-ACT

Il gene umano **DHX9** codifica per l’elicasi DExH-box **NDH II**, un’elicasi multifunzionale RNA/DNA che regola la trascrizione, la maturazione del pre-mRNA, l’esportazione dell’mRNA, la traduzione e il mantenimento della stabilità del genoma. NDH II partecipa al metabolismo degli **R-loop** e risolve acidi nucleici strutturati, collegandosi così alla segnalazione della risposta al danno al DNA e alle vie della risposta allo stress replicativo. Attraverso interazioni con complessi ribonucleoproteici e acidi nucleici associati ai promotori, DHX9 può influenzare programmi di espressione genica dell’immunità innata e della risposta allo stress. Alterazioni dell’attività o dell’espressione di DHX9 sono state associate a una deregolazione del processamento dell’RNA e a instabilità legata alla cromatina osservate in molteplici contesti cellulari rilevanti per la patologia, a supporto del suo impiego come bersaglio meccanicistico nella genomica funzionale.

NDH II Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di DHX9 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

NDH II Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus DHX9 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione DHX9, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di NDH II. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus DHX9 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da NDH II nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via NDH II nelle cellule tumorali con espressione di DHX9 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.