Na⁺ CP type Xα Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-407011-ACT

SCN10A codifica il canale del sodio voltaggio-dipendente Na+ CP di tipo Xα (Nav1.8), un canale resistente alla tetrodotossina che sostiene l’innesco del potenziale d’azione e la scarica ripetitiva nelle cellule eccitabili, in particolare nei neuroni sensoriali periferici. Modellando l’ingresso di sodio e la dinamica della depolarizzazione di membrana, Nav1.8 contribuisce all’eccitabilità neuronale, alla segnalazione evocata dagli stimoli e a programmi genici dipendenti dall’attività legati al rimodellamento dei canali ionici. La regolazione di SCN10A si intreccia con processi più ampi di elettrofisiologia e di segnalazione neuroinfiammatoria che influenzano la nocicezione e la funzione dei nervi periferici. Varianti genetiche e una deregolazione dell’espressione di SCN10A sono state associate ad alterazioni dei fenotipi dolorifici e a caratteristiche dell’elettrofisiologia cardiaca, a supporto del suo impiego in studi meccanicistici dei disturbi legati all’eccitabilità.

Na+ CP type Xα Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di SCN10A senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Na+ CP type Xα Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus SCN10A nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione SCN10A, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Na+ CP type Xα. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus SCN10A nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Na+ CP type Xα nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Na+ CP type Xα nelle cellule tumorali con espressione di SCN10A silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.