NARC-1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402445-ACT

PCSK9 codifica la proteasi serinica secreta NARC-1, un regolatore post-traduzionale chiave dell’omeostasi del colesterolo attraverso il controllo dell’abbondanza del recettore delle LDL (LDLR) sulla superficie degli epatociti. Promuovendo l’internalizzazione e la degradazione lisosomiale di LDLR, PCSK9 modula il riciclo del recettore e influenza l’assorbimento delle lipoproteine, integrandosi con i programmi metabolici lipidici guidati da SREBP. L’espressione e l’attività di PCSK9 intersecano il traffico dal reticolo endoplasmatico al Golgi, le fasi di processamento della via secretoria e le dinamiche extracellulari recettore–ligando. Una segnalazione di PCSK9 deregolata è fortemente associata ad alterazioni del colesterolo LDL plasmatico e alla suscettibilità alle malattie cardiometaboliche, rendendolo un bersaglio ampiamente utilizzato per studi meccanicistici sulla regolazione dei lipidi.

NARC-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di PCSK9 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

NARC-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus PCSK9 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione PCSK9, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di NARC-1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus PCSK9 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da NARC-1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via NARC-1 nelle cellule tumorali con espressione di PCSK9 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.