Nanog Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-428155-ACT

Nanog di topo codifica un fattore di trascrizione homeobox che funge da regolatore centrale della pluripotenza e dell’autorinnovamento nell’embrione preimpianto e nelle cellule staminali embrionali. NANOG coopera con OCT4 e SOX2 per stabilire il circuito trascrizionale di base, interagendo al contempo con vie di rimodellamento della cromatina e di controllo epigenetico che regolano l’impegno di linea e la repressione dei programmi di differenziamento. L’alterazione dell’espressione di NANOG è ampiamente utilizzata come marcatore di stati cellulari di tipo staminale ed è implicata in meccanismi che sostengono un autorinnovamento aberrante, la transizione epitelio–mesenchimale e la resistenza ai segnali di differenziamento in modelli rilevanti per la malattia. Queste proprietà rendono Nanog un bersaglio chiave per indagare le reti regolatorie geniche dello sviluppo, le transizioni di destino cellulare e la riprogrammazione guidata da fattori di trascrizione.

Nanog Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Nanog senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Nanog Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Nanog nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Nanog, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Nanog. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Nanog nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Nanog nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Nanog nelle cellule tumorali con espressione di Nanog silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.