NALCN Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403432-ACT

NALCN codifica la proteina del canale di perdita del sodio non selettivo, un componente di membrana che forma il poro e che media una conduttanza basale di Na+ indipendente dal voltaggio, contribuendo a determinare il potenziale di membrana a riposo e l’eccitabilità intrinseca nei neuroni e in altre cellule eccitabili. Modulando la spinta depolarizzante di base, la funzione di NALCN si interseca con reti di segnalazione che regolano la scarica ritmica, l’integrazione sinaptica e il controllo omeostatico del potenziale di membrana. Un’attività o un’espressione di NALCN deregolate sono state associate a fenotipi neurosviluppo e neuromotori, inclusi alterazioni del ritmo respiratorio e ipotonia, a conferma del suo ruolo nel funzionamento dei circuiti dipendente dall’eccitabilità. Nei modelli cellulari umani, la modulazione di NALCN offre uno strumento pratico per studiare l’elettrofisiologia di membrana, la regolazione dei canali ionici e le risposte trascrizionali a valle indotte da variazioni dell’eccitabilità.

NALCN Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di NALCN senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

NALCN Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus NALCN nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione NALCN, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di NALCN. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus NALCN nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da NALCN nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via NALCN nelle cellule tumorali con espressione di NALCN silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.