myocilin Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401843-ACT

O MYOC humano codifica a miocilina, uma glicoproteína extracelular secretada e enriquecida em tecidos oculares, que contribui para a organização da matriz extracelular, a adesão celular e a modulação da dinâmica do citoesqueleto. A miocilina associa-se a processos de controle de qualidade do retículo endoplasmático e pode influenciar a proteostase e a sinalização de estresse quando se encontra mal dobrada, afetando a secreção e a remodelação da matriz. Alterações na expressão de MYOC ou no processamento da proteína têm sido associadas a desregulação do escoamento do humor aquoso e à disfunção da malha trabecular, tornando-o relevante para estudos da homeostase da pressão intraocular. Essas funções colocam o MYOC na interface entre vias de matriz extracelular, tráfego vesicular e respostas celulares ao estresse usadas para investigar a biologia celular ocular.

myocilin O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de MYOC sem alterar a sequência de ADN subjacente.

myocilin O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus MYOC em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição MYOC, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de myocilin. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus MYOC nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de myocilin no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via myocilin em células tumorais com expressão de MYOC silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.