MYL3 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403198-ACT

MYL3 codifica la catena leggera della miosina 3, una componente regolatoria del complesso motore della miosina II che modula il ciclo dei ponti trasversali actina–miosina e la generazione di forza contrattile nel muscolo striato. Regolando l’attività ATPasica della miosina e le interazioni tra filamenti, MYL3 contribuisce all’organizzazione del sarcomero, alla contrattilità sensibile al calcio e alla meccanica miofibrillare. Alterazioni dell’espressione di MYL3 o sue varianti sono state associate a fenotipi cardiomiopatici e a una compromissione della funzione del muscolo cardiaco, rendendolo un marcatore utile per studiare la biologia del sarcomero e la segnalazione associata alla contrattilità. MYL3 umano è quindi rilevante per indagare lo sviluppo muscolare, le risposte allo stress meccanico e le vie che regolano struttura e prestazioni dei cardiomiociti.

MYL3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di MYL3 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

MYL3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus MYL3 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione MYL3, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di MYL3. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus MYL3 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da MYL3 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via MYL3 nelle cellule tumorali con espressione di MYL3 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.