mtTFA Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-423355-ACT

Tfam codifica per il fattore di trascrizione mitocondriale A (mtTFA), una proteina del gruppo ad alta mobilità (HMG) che si lega al DNA mitocondriale per impacchettare i nucleoidi e regolare la trascrizione e la replicazione del genoma mitocondriale. mtTFA è un determinante centrale del numero di copie del mtDNA e dell’espressione dei geni mitocondriali, influenzando così la fosforilazione ossidativa, la produzione di ATP e l’omeostasi delle specie reattive dell’ossigeno. Attraverso questi ruoli, si integra con i programmi di biogenesi mitocondriale e con le vie di comunicazione nucleo–mitocondrio che modellano il metabolismo cellulare e le risposte allo stress. Alterazioni dell’attività di TFAM e del mantenimento del mtDNA sono spesso oggetto di studio in modelli di disfunzione neuromuscolare, neurodegenerazione, fenotipi cardiometabolici e infiammazione guidata dalla segnalazione di stress mitocondriale.

mtTFA Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Tfam senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

mtTFA Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Tfam nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Tfam, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di mtTFA. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Tfam nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da mtTFA nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via mtTFA nelle cellule tumorali con espressione di Tfam silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.