MRTF-B Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401793-ACT

Il gene umano **MKL2** codifica il fattore di trascrizione correlato a myocardin B (**MRTF-B**), un coattivatore sensibile alla dinamica RhoA–actina che interagisce con **SRF** per regolare programmi genici del citoscheletro che controllano forma cellulare, migrazione e contrattilità. L’attività di MRTF-B integra segnali derivanti dalla polimerizzazione dell’actina e dalla meccanotrasduzione per modulare reti trascrizionali coinvolte nello sviluppo della muscolatura liscia e del sistema cardiovascolare, nonché nel rimodellamento tissutale. Una deregolazione della via di segnalazione MKL2/MRTF-B–SRF è stata associata a transizione epitelio-mesenchimale aberrante, comportamento invasivo e risposte fibroproliferative in molteplici sistemi modello. In quanto nodo che collega il rimodellamento dell’actina all’output trascrizionale, MRTF-B è ampiamente studiato nei pathway che governano adesione, formazione di fibre di stress e regolazione della matrice extracellulare.

MRTF-B Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di MKL2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

MRTF-B Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus MKL2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione MKL2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di MRTF-B. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus MKL2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da MRTF-B nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via MRTF-B nelle cellule tumorali con espressione di MKL2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.